不同pH值生物聚合物无固相钻井液中巴氏芽孢杆菌的生长预测模型

摘要

微生物诱导碳酸钙沉积（MICP）技术为地质钻探行业解决破碎地层孔壁失稳难题提供了有益借鉴，探究微生物在钻井液环境条件下的生长规律是成功应用MICP技术解决破碎地层孔壁失稳的首要前提。因此，本研究检测了pH值为7.0、7.4、7.8、8.2、8.6、9.0、9.4、9.8、10.0条件下巴氏芽孢杆菌在生物聚合物（XC）钻井液中的生长情况，对其生长规律进行分析和拟合，并构建了其生长预测模型。结果表明：在实验设定的pH值条件下，巴氏芽孢杆菌均能正常生长。综合比较各模型的回归系数、均方误差、赤池信息量准则、准确因子和偏差因子可知，修正Gompertz模型更适合描述巴氏芽孢杆菌在XC钻井液中的生长情况，Arrhenius模型更适合描述pH值对XC钻井液中巴氏芽孢杆菌的最大比生长率的影响规律。研究结果为利用MICP技术稳定破碎地层孔壁的成功应用奠定了良好的理论基础和提供了科学依据。

关键词

破碎地层; 孔壁失稳; 巴氏芽孢杆菌; MICP技术; 生长预测模型; 生物聚合物钻井液

0 引言

破碎地层是地质钻探工程常见的复杂地层之一，此类地层具有裂隙发育、胶结性差、破碎不完整、强度低等特点，在钻进过程中，极易发生孔壁失稳^［1-3］，对钻孔施工造成了巨大困难。优质钻井液体系具有良好的稳定孔壁能力，但钻遇破碎地层时，在孔内钻柱、钻具的机械扰动和钻井液渗入地层产生的润滑作用下，其护壁效果十分有限^［4-6］。因此，亟需探索一种钻井液新技术解决破碎地层孔壁失稳难题。研究表明，增强破碎地层的胶结力，提升孔壁完整性，是维持该类地层孔壁稳定的技术关键。

微生物诱导碳酸钙沉积（MICP）技术为解决破碎地层孔壁失稳问题提供了很好的借鉴。MICP利用微生物产生的脲酶催化尿素分解产生$\mathrm{C}{\mathrm{O}}_{\mathrm{3}}^{\mathrm{2}-}$，与周围环境中的Ca²⁺相互作用，产生具有胶结作用的碳酸钙沉淀。其化学反应见式（1）和式（2）：

$$\mathrm{C}\mathrm{O}{\left(\mathrm{N}{\mathrm{H}}_{\mathrm{2}}\right)}_{\mathrm{2}}+\mathrm{2}{\mathrm{H}}_{\mathrm{2}}\mathrm{O}\stackrel{\mathrm{u}\mathrm{r}\mathrm{e}\mathrm{a}\mathrm{s}\mathrm{e}}{\to }\mathrm{2}\mathrm{N}{\mathrm{H}}_{\mathrm{4}}^{+}+\mathrm{C}{\mathrm{O}}_{\mathrm{3}}^{\mathrm{2}-}$$

（1）

$$\mathrm{C}{\mathrm{a}}^{\mathrm{2}+}+\mathrm{C}{\mathrm{O}}_{\mathrm{3}}^{\mathrm{2}-}\to \mathrm{C}\mathrm{a}\mathrm{C}{\mathrm{O}}_{\mathrm{3}}\downarrow$$

（2）

研究发现，利用巴氏芽孢杆菌构建的微生物钻井液体系，可以诱导碳酸钙产生沉淀，胶结碎石土成型，并且有一定的无侧限抗压强度和更低的渗透性^［8-9］。但巴氏芽孢杆菌的生长会受到pH值变化的影响^［10］，在钻探过程中，钻井液的pH值会产生波动，但总体处在碱性环境中^［11］。因此，探究巴氏芽孢杆菌在不同pH值条件下的生长规律并构建其生长预测模型具有重要意义。

常用的生长预测模型分为一级模型和二级模型，一级生长预测模型主要有Logistic模型、Baranyi模型和Gompertz模型等，二级生长预测模型有平方根模型、Arrhenius模型和Cardinal模型等。在食品、医疗等领域中，利用生长预测模型预测、分析得到的微生物生长规律，为食品的制造和加工，药物研发提供了重要的科学依据^［12-14］。

因此，本文将通过实验，研究生物聚合物（XC）无固相钻井液中，在30 ℃、不同pH值（7.0、7.4、7.8、8.2、8.6、9.0、9.4、9.8、10.0）条件下，巴氏芽孢杆菌的生长规律。采用不同的生长预测模型，对巴氏芽孢杆菌生长的实验数据进行拟合，利用回归系数、均方误差、赤池信息量准则、准确因子和偏差因子等为判别标准，探究适合描述巴氏芽孢杆菌在不同pH值条件下的生长预测模型，以此为利用MICP技术稳定破碎地层孔壁的成功应用奠定良好的理论基础并提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

本文使用巴氏芽孢杆菌菌种采购自中国微生物菌种查询中心［冻干粉，编号DSM33（2015-01-07）］，其他材料见表1。

表1  实验用其他材料

材料	来　源	规格型号
生物聚合物（XC）	山东圣煌化工产品有限责任公司
酪蛋白胨、大豆蛋白胨	北京索莱宝科技有限公司	生物试剂
氯化钠	福晨（天津）化学试剂有限公司	化学纯
氢氧化钠	西陇化工股份有限公司	化学纯
去离子水	成都市科隆化学品有限公司

1.2 实验方法

1.2.1 巴氏芽孢杆菌的活化与培养

取1 L去离子水，在其中加入5 g大豆蛋白胨、15 g酪蛋白胨、5 g氯化钠并搅拌均匀，后用1 mol/L的氢氧化钠溶液滴定至其pH为7.3，得到巴氏芽孢杆菌液体培养基。使用高温高压灭菌锅（上海博迅实业有限公司，YXQ-SG46-280S）对液体培养基在1.05 MPa、110 ℃条件下进行灭菌10 min，后放置于超净工作台（苏州安泰空气技术有限公司，SW-CJ1FD），待其冷却至室温。

用无菌移液枪吸取少量灭菌后的液体培养基于安瓿瓶中，待瓶内乳白色粉末全部变为悬浮状后，将其全部转移至灭菌的装有液体培养基的三角瓶中，用医用纱布封口。放置于恒温振荡培养箱（上海知楚仪器有限公司，ZHTY-50s）内，在30 ℃、200 r/min条件下培养24 h后，观察到液体培养基明显浑浊，说明活化成功。后进行2次继代培养，获得菌液。

1.2.2 XC无固相钻井液配置及其性能参数

将3 g XC加入到1 L去离子水中，充分搅拌，获得0.3%（质量/体积，下同）浓度的XC无固相钻井液，其性能参数见表2。

表2  XC无固相钻井液的性能参数

浓度/ %	密度/ (g∙cm-3)	漏斗粘度/s	表观粘度/(mPa∙s)	塑性粘度(mPa.s)	动切力/Pa
0.3	0.99	29.76	13.75	7.0	6.90

1.2.3 巴氏芽孢杆菌接种

将5 mL菌液、45 mL灭菌的液体培养基、50 mL浓度为0.6%的无固相钻井液注入锥形瓶中混合均匀，用1 mol/L的氢氧化钠溶液将混合液体的pH值调节到实验设定值，用医用纱布封口后置于振荡培养箱中，30 ℃、200 r/min条件下培养24 h。

1.2.4 巴氏芽孢杆菌数量检测

每隔2 h取样5 mL于比色皿中，放入分光光度计（上海尤尼柯仪器有限公司，UV2000），在600 nm波长时的吸光度（OD₆₀₀）来测定菌种数量，因此，直接采用OD₆₀₀值来表示菌种浓度。每次实验重复3次，取平均值作为结果。

1.3 生长预测模型

1.3.1 一级生长预测模型

一级生长预测模型是用来描述微生物的数量与时间的关系。本文采用修正的Gompertz模型和Logistic模型拟合不同pH下巴氏芽孢杆菌的生长规律，对比拟合精度，选择更优模型用于描述巴氏芽孢杆菌生长情况。

1.3.1.1 修正Gompertz模型

修正Gompertz模型如式（3）所示：

$$N(t)=A+C·\mathrm{e}\mathrm{x}\mathrm{p}[-\mathrm{e}\mathrm{x}\mathrm{p}(\frac{\mathrm{2.718}{\mu }_{\mathrm{m}\mathrm{a}\mathrm{x}}(\lambda -t)}{C}+\mathrm{1})]$$

（3）

式中：$N(t)$——在时间t时微生物数量；$A$——随时间无限减小时的渐近值（相当于初始菌种数量）；$C$——时间无限增加时菌种的增量，即初始菌种数和最大菌种数之间的差值；${\mu }_{max}$——微生物的最大比生长速率；$\lambda$——延滞期时长。

1.3.1.2 Logistic模型

Logistic模型如式（4）所示：

$$N(t)=\frac{A}{\{\mathrm{1}+\mathrm{e}\mathrm{x}\mathrm{p}[\frac{\mathrm{4}{\mu }_{\mathrm{m}\mathrm{a}\mathrm{x}}}{A}(\lambda -t)+\mathrm{2}\}}$$

（4）

式中：$N(t)$——在时间t时微生物数量；$A$——最大菌种数量，OD₆₀₀；${\mu }_{max}$——微生物的最大比生长速率；$\lambda$———延滞期时长。

1.3.2 二级生长预测模型

二级生长预测模型用于描述一级模型参数与单个或多个环境变量之间的关系，包括Arrhenius模型、平方根模型等^［15］。本研究选用这2种模型拟合pH与最大比生长速率${\mu }_{max}$之间的关系，从而构建二级生长预测模型。

1.3.2.1 Arrhenius模型

Arrhenius模型表达式见式（5）：

$$\mathrm{l}\mathrm{n}{\mu }_{\mathrm{m}\mathrm{a}\mathrm{x}}=a+b/H+c/H_{\mathrm{2}}$$

（5）

为方便模型应用，将式（5）变形为式（6）：

$$\sqrt[]{{\mu }_{\mathrm{m}\mathrm{a}\mathrm{x}}}=\sqrt[]{\mathrm{e}\mathrm{x}\mathrm{p}(a+b/H+c/H^{\mathrm{2}}}$$

（6）

式中：${\mu }_{\mathrm{m}\mathrm{a}\mathrm{x}}$——微生物的最大比生长速率；$a、b、c$——模型系数；H——pH值。

1.3.2.2 平方根模型

平方根模型是由Ratkowsky等建立的一种简便的经验模型^［16］，用于描述温度与微生物最大生长比速率。Zwietering等^［17］研究认为，pH对微生物生长速率的影响可以用平方根模型来反映，得到pH与${\mu }_{max}$间的平方根模型，见式（7）：

$$\sqrt[]{{\mu }_{\mathrm{m}\mathrm{a}\mathrm{x}}}=\alpha (H-H_{\mathrm{m}\mathrm{i}\mathrm{n}})$$

（7）

式中：${\mu }_{\mathrm{m}\mathrm{a}\mathrm{x}}$——微生物的最大比生长速率；$\alpha$——模型系数；$H$——pH值；$H_{\mathrm{m}\mathrm{i}\mathrm{n}}$——微生物生长速率为零时的pH值。

1.3.3 模型拟合评价

本文采用均方误差（MSE）、赤池信息量准则（AIC）和回归系数（R²）等3种指标来对比评价一级生长预测模型的拟合精确度，其中MSE、AIC值越小，R²越接近于1，则表示模型拟合越精确。采用MSE、R²、准确因子（A_f）和偏差因子（B_f）等4种指标来对比评价二级生长预测模型的拟合精确度，其中MSE值越小，R²、A_f、B_f值越接近于1，则表示模型拟合越精确^［18］。评价公式见式（8）~式（12）：

$$MSE=\frac{SSE}{N}$$

（8）

$$R^{\mathrm{2}}=\mathrm{1}-\frac{SSE}{SST}$$

（9）

$$AIC=N\times \mathrm{l}\mathrm{n}\left(\frac{SSE}{N}\right)+\mathrm{2}\left(P+\mathrm{1}\right)+\frac{\mathrm{2}(P+\mathrm{1})(P+\mathrm{2})}{d_f-\mathrm{2}}$$

（10）

$$A_f={\mathrm{10}}^{\frac{{\sum }_{i=\mathrm{1}}^N\left|\mathrm{l}\mathrm{g}(\frac{\widehat{y}}{y_i})\right|}{N}}$$

（11）

$$B_f={\mathrm{10}}^{\frac{{\sum }_{i=\mathrm{1}}^N\mathrm{l}\mathrm{g}(\frac{\widehat{y}}{y_i})}{N}}$$

（12）

式中：$y_i$——实际观测值；$\widehat{y}$——模型拟合值；$N$——数据点个数；$P$——模型中参数个数；$d_f$——自由度；$SSE={\sum }_i(\widehat{y}-y_i{)}^{\mathrm{2}}$；$SST={\sum }_i(\widehat{y}-y_i{)}^{\mathrm{2}}$；$\overline{y}$——实际观测值均值。

2 结果与讨论

2.1 巴氏芽孢杆菌在液体培养基中的生长情况

巴氏芽孢杆菌在液体培养基中的生长情况见图1。

图1  巴氏芽孢杆菌在培养基中的生长情况

图1中，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ分别对应了巴氏芽孢杆菌在培养基中生长的延滞期、对数生长期和稳定期。前4 h内，巴氏芽孢杆菌处于延滞期，主要以个体增长为主，数量变化不明显。4 h后，巴氏芽孢杆菌进入对数生长期，经过延滞期的适应和物质积累，开始迅速繁殖，数量增长明显，且此时数量增长不受底物限制，只受其生理机能影响。18 h后，巴氏芽孢杆菌进入稳定期，随着底物的消耗，其生长速率明显放缓，其数量达到最高且趋于稳定，细胞代谢产物积累达到最高，芽孢开始形成^［19］。

2.2 巴氏芽孢杆菌在XC无固相钻井液中的生长情况

在XC无固相钻井液中，巴氏芽孢杆菌在不同pH值条件下的生长情况见图2。

图2  巴氏芽孢杆菌在不同pH值条件下的生长情况

由图2可知，pH值在7.0~9.0范围内，巴氏芽孢杆菌并没有明显的延滞期，直接进入对数生长期，20 h后有进入稳定期的趋势，24 h内并未进入衰退期，整体的生长曲线接近，生长速率都随着时间增长下降。pH值在9.4~10.0范围内，巴氏芽孢杆菌受到碱性环境的影响，在经过2~4 h的延滞期后开始进入对数生长期，22 h后逐渐进入稳定期，但生长速率比pH值在7.0~9.0条件下的巴氏芽孢杆菌更高，整体的菌种数量更低。随着pH值的升高，巴氏芽孢杆菌在24 h时的数量并未表现为逐渐下降的趋势，而是表现为波动下降。pH值在7.0~10.0范围内，pH值的升高对巴氏芽孢杆菌的生长有较明显的影响。

2.3 一级生长预测模型

采用修正Gompertz模型和Logistic模型对不同pH值条件下巴氏芽孢杆菌的生长规律进行拟合，拟合曲线见图3。

图3  巴氏芽孢杆菌在各pH值下一级生长预测模型拟合曲线

由图3可知，2种模型可以较好地拟合出巴氏芽孢杆菌在0.3%XC无固相钻井液的生长状况，曲线反映出巴氏芽孢杆菌24 h内的生长与时间呈正相关关系。通过对比2种一级生长预测模型拟合参数（表3），选择出能够更加精确描述各pH条件下巴氏芽孢杆菌生长规律的一级生长预测模型。

表3  各pH值条件下巴氏芽孢杆菌一级生长预测模型拟合参数

pH值	修正Gompertz模型			Logistic模型
	MSE	R2	AIC	MSE	R2	AIC
7.0	0.000371	0.99816	-84.1145	0.002706	0.98791	-63.8584
7.4	0.004513	0.98205	-51.6377	0.009923	0.96447	-46.9675
7.8	0.001036	0.99671	-70.77	0.005122	0.98536	-55.5667
8.2	0.001227	0.99572	-68.5702	0.006664	0.97909	-52.1444
8.6	0.002425	0.99175	-59.7129	0.008345	0.97445	-49.2198
9.0	0.001872	0.99248	-63.0785	0.008761	0.96831	-48.587
9.4	0.018537	0.95038	-33.2724	0.025029	0.9397	-34.9403
9.8	0.012916	0.96428	-37.9693	0.016591	0.9587	-40.2859
10.0	0.009551	0.96726	-41.8935	0.012622	0.96106	-43.8399

由表3可知，pH值为7.0、7.4、7.8、8.2、8.6、9.0时，修正Gompertz模型的MSE、AIC值更小，R²更接近1，且都高于0.98，说明以上条件下修正Gompertz模型可以更好地描述巴氏芽孢杆菌在XC无固相钻井液的生长状况。pH值为9.4、9.8、10.0时，修正Gompertz模型的MSE值更小，R²更接近1，尽管Logistic模型的AIC值更小，但二者极其接近，所以认为修正Gompertz模型的拟合更优。由此可知，在XC无固相钻井液中，巴氏芽孢杆菌在不同pH值条件下，修正Gompertz模型更适合描述其生长规律。各pH值条件下其一级生长预测模型见表4。

表4  巴氏芽孢杆菌在各pH值条件下的一级生长预测模型

pH值	预测模型	表　达　式
7.0	修正Gompertz	$N(t)=-5.80559+8.014\times \mathrm{e}\mathrm{x}\mathrm{p}[-\mathrm{e}\mathrm{x}\mathrm{p}(2.718\times \frac{0.12737\times (-22.4508-t)}{8.014}+1)]$
7.4	修正Gompertz	$N(t)=-0.78989+2.72346\times \mathrm{e}\mathrm{x}\mathrm{p}[-\mathrm{e}\mathrm{x}\mathrm{p}(2.718\times \frac{0.14785\times (-5.3437-t)}{2.72346}+1)]$
7.8	修正Gompertz	$N(t)=-0.73275+3.00865\times \mathrm{e}\mathrm{x}\mathrm{p}[-\mathrm{e}\mathrm{x}\mathrm{p}(2.718\times \frac{0.15266\times (-5.5678-t)}{3.00865}+1)]$
8.2	修正Gompertz	$N(t)=-2.56674+4.83611\times \mathrm{e}\mathrm{x}\mathrm{p}[-\mathrm{e}\mathrm{x}\mathrm{p}(2.718\times \frac{0.15172\times (-12.92903-t)}{4.83611}+1)]$
8.6	修正Gompertz	$N(t)=-0.42322+2.38727\times \mathrm{e}\mathrm{x}\mathrm{p}[-\mathrm{e}\mathrm{x}\mathrm{p}(2.718\times \frac{0.15034\times (-2.51697-t)}{2.38727}+1)]$
9.0	修正Gompertz	$N(t)=-1.95087+3.89056\times \mathrm{e}\mathrm{x}\mathrm{p}[-\mathrm{e}\mathrm{x}\mathrm{p}(2.718\times \frac{0.19527\times (-10.05199-t)}{3.89056}+1)]$
9.4	修正Gompertz	$N(t)=-0.179+1.79929\times \mathrm{e}\mathrm{x}\mathrm{p}[-\mathrm{e}\mathrm{x}\mathrm{p}(2.718\times \frac{0.17279\times (5.03696-t)}{1.79929}+1)]$
9.8	修正Gompertz	$N(t)=0.16821+1.86668\times \mathrm{e}\mathrm{x}\mathrm{p}[-\mathrm{e}\mathrm{x}\mathrm{p}(2.718\times \frac{0.15253\times (4.61742-t)}{1.86668}+1)]$
10.0	修正Gompertz	$N(t)=0.12724+1.86133\times \mathrm{e}\mathrm{x}\mathrm{p}[-\mathrm{e}\mathrm{x}\mathrm{p}(2.718\times \frac{0.12369\times (6.72533-t)}{1.86133}+1)]$

2.4 二级生长预测模型

一级生长预测模型可以准确描述巴氏芽孢杆菌在XC无固相钻井液中指定pH值条件下的生长情况，但不能直接反映出pH值对与生长的影响规律。因此采用Arrhenius模型和平方根模型分别拟合巴氏芽孢杆菌的最大比生长速率与pH值之间的关系，拟合结果如图4所示，拟合参数如表5和表6所示。

图4  不同pH值条件下巴氏芽孢杆菌二级生长预测模型拟合曲线

表5  pH值为7.0~8.6时的拟合参数

预测模型	MSE	R2	Af	Bf
Arrhenius	2.04×10-6	0.93377	1.00551	0.99997
平方根	2.75×10-5	0.40608	1.02043	0.99975

表6  pH值为9.0~10.0时的拟合参数

预测模型	MSE	R2	Af	Bf
Arrhenius	1.21×10-5	0.89212	1.01299	0.99837
平方根	2.04×10-5	0.90930	1.01710	0.99827

由表5知，平方根模型拟合得到的R²<0.5，不能很好地描述最大生长比速率与pH值间的关系，而Arrhenius模型的MSE值更小，R²、A_f、B_f值更接近1，可知Arrhenius模型可以更好地描述pH值与最大比生长速率之间的关系，因而得到二级生长预测模型如式（13）。

$$\sqrt[]{{\mu }_{\mathrm{m}\mathrm{a}\mathrm{x}}}=\sqrt[]{\mathrm{e}\mathrm{x}\mathrm{p}(-\mathrm{10.32442}+\frac{\mathrm{135.89083}}{T}-\frac{\mathrm{545.895}}{T^{\mathrm{2}}}}$$

（13）

由表6可知，2个模型的拟合都较优且十分接近，平方根模型的R²略高于Arrhenius模型，但MSE、A_f更大，B_f更小，综合选择Arrhenius模型描述巴氏芽孢杆菌最大生长比速率与pH值间的关系，得到二级生长预测模型如式（14）。

$$\sqrt[]{{\mu }_{\mathrm{m}\mathrm{a}\mathrm{x}}}=\sqrt[]{\mathrm{e}\mathrm{x}\mathrm{p}(-\mathrm{35.89991}+\frac{\mathrm{609.16129}}{T}-\frac{\mathrm{2707.37405}}{T^{\mathrm{2}}}}$$

（14）

3 结论

本文通过实验及理论研究，探讨在XC无固相钻井液中，巴氏芽孢杆菌在不同pH值条件下的生长规律，并通过模型拟合分析，得到了在不同pH值条件下，巴氏芽孢杆菌的一级生长预测模型和二级生长预测模型，为利用MICP技术维护破碎地层孔壁稳定的成功应用奠定了良好的理论基础和提供了科学依据。取得的研究结论如下：

（1）通过检测pH值为7.0、7.4、7.8、8.2、8.6、9.0、9.4、9.8、10.0条件下巴氏芽孢杆菌在XC钻井液中的生长情况，发现巴氏芽孢杆菌数量随着pH值的升高，表现出波动下降，在pH值为7.8时的生长情况最好。

（2）对巴氏芽孢杆菌在XC无固相钻井液中生长规律的拟合显示，修正Gompertz模型更适合作为其一级生长预测模型，能更准确描述各pH值条件下巴氏芽孢杆菌的生长规律；Arrhenius模型更适合作为其二级生长预测模型，能更准确描述各pH值与最大比生长速率之间的关系。

（3）本文研究表明，钻井液pH值的变化对巴氏芽孢杆菌的生长情况具有明显的影响，为了弱化pH值对其生长的影响，甚至使巴氏芽孢杆菌在更高pH值条件下能够良好生长，需要开展巴氏芽孢杆菌耐碱诱导驯化研究工作，使其在工程应用过程中护壁能力更加稳定。